Культивирование и трансплантация фибробластов - область биомедицины, имеющая начало более века назад, но получившая свое настоящее развитие в последние 30 - 40 лет, когда появились методики, обусловившие возможность культивирования отдельных клеток. Сегодня значительное количество из нескольких сотен типов клеток, составляющих человеческий организм, успешно размножаются in vitro. В их число входят и фибробласты.
Следствием развития и совершенствования клеточной биологии явилось формирование нового направления клеточной и тканевой инженерии, относящегося к биомедицинской технологии, основанной на использовании культивированных клеток человека. Задача этого направления - обеспечение замещения, восстановления поврежденных тканей за счет имплантации или трансплантации выращенных in vitro клеток из здоровых тканей и органов. Возможность культивирования в достаточном объеме необходимых для практики фибробластов делает реальным их использование в клинике. В России это направление получило развитие в ряде научных и практических учреждений: Институт цитологии РАН, Военно-медицинская академия МО РФ, Институт хирургии им. А.В. Вишневского РАМН, Институт кардиологии МЗ РФ, НИИ трансплантологии и искусственных органов, Институт Клеточных Технологий и др.
Фибробласты - основные клетки соединительной ткани. Эти клетки имеют мезенхимальное происхождение и морфологически характеризуются как клетки круглой или удлиненной, веретенообразной плоской формы с отростками и плоским овальным ядром. Фибробласты синтезируют тропоколлаген, предшественник коллагена, межклеточный матрикс и основное вещество соединительной ткани, аморфное желе подобное вещество, заполняющее пространство между клетками и волокнами соединительной ткани. Участвуют в заживлении ран. В результате дифференцирования фибробласты превращаются в менее активные зрелые клетки - фиброциты.
Около 100 лет тому назад в связи с развитием методов поддержания клеток in vitro со всей остротой встал вопрос о том, ограничен ли потенциал клеток многоклеточного организма. A.Каррель культивировал фибробласты сердца куриных эмбрионов в культуре в течение 34 лет, при этом клетки прошли тысячи делений без изменений их морфологического строения или скорости роста. Эти опыты встретили серьезные возражения. В частности, указывалось, что несовершенство методов культивирования приводило к внесению свежих клеток в культуры при каждом их пересеве. С другой стороны, онкологам хорошо известны многочисленные штаммы перевиваемых in vivo и in vitro опухолевых штаммов и линий, которые поддерживаются в течение многих лет, иногда десятков лет, клетки которых являются практически бессмертными (иммортализированными). Наряду с этими опытами, появились наблюдения о том, что в клеточных культурах все же не удается длительно поддерживать клетки, полученные из нормальных, не опухолевых тканей.
В 1961 г. L.Hayflick и P.S.Moorhead представили данные о том, что даже в идеальных условиях культивирования фибробласты эмбриона человека способны делиться только ограниченное число раз (50 ≈ 10). Было установлено, что при самом тщательном соблюдении всех мер предосторожности при пересевах клетки проходят in vitro ряд вполне морфологически различимых стадий (фаз), после чего их способность к пролиферации исчерпывается и в таком состоянии способны находиться довольно длительное время. В повторных опытах это наблюдение было многократно воспроизведено, последняя фаза жизни клеток в культуре была уподоблена клеточному старению, а сам феномен получил по имени автора название лимита Хейфлика. Более того, оказалось, что с увеличением возраста донора число делений, которые были способны совершить клетки организма, существенно уменьшалось, что привело к представлению о существовании гипотетического счетчика делений, ограничивающего общее их число.
После установления лимита Хейфлика и фактов, что нормальные фибробласты в культуре сохраняют диплоидный кариотип и имеют низкую экспрессию антигенов гистосовместимости и отсутствие онкогенных потенций, стало возможно использование культивируемых вне организма фибробластов человека для терапевтических целей. Научные исследования и клинические разработки в данном направлении протекают очень интенсивно, что связано с общим подъемом клеточных технологий на основе стволовых клеток.
Попытки использовать культивируемые вне организма фибробласты для терапевтических целей начали предприниматься вскоре после установления фактов, что нормальные фибробласты в культуре сохраняют диплоидный кариотип и имеют ограниченную продолжительность жизни, низкую экспрессию антигенов гистосовместимости, отсутствие онкогенных потенций. Было показано, что пересаженные аллогенные фибробласты оказывают непосредственное влияние на заживление ран (Ross, 1968) и на эпителизацию (Coulomb et el, 1989). Появились данные, что фибробласты могут продуцировать коллагены I и II типов (Varga et al., 1987) и компоненты внеклеточного матрикса: ламинин, нидоген, тинасцин, хондроитин-4-сульфат, протеогликан (Halfter et al., 1990), фибронектин (Matsura, Hakamori, 1985), некоторые факторы роста, а также другие вещества.
В настоящее время имеется значительное число работ, свидетельствующих о большой роли факторов роста в эпителизации кожи. Факторы роста - это регуляторные пептиды (тканевые гормоны), вырабатываемые клетками различных типов, которые в значительной степени ускоряют регенераторный процесс.
Многие факторы роста продуцируются фибробластами:
• Основной фактор роста фибробластов (bFGF) положительно влияет на рост всех типов клеток кожи, стимулирует продукцию компонентов внеклеточного матрикса фибробластами (фибронектина и коллагена), стимулирует хемотаксис фибробластов и выработку ими новых волокон коллагена, эластина и фибронектина;
• Трансформирующий ростовой фактор (TGF-бета) стимулирует хемотаксис фибробластов и продукцию ими коллагена и фибронектина (Капе С. et al., 1991);
• Трансформирующий ростовой фактор (TGF-альфа) влияет на ангиогенез (Chen J., et al., 1993). Продуцируемые фибробластами факторы роста могут ускорять восстановление пораженной дермы, что во многом объясняет стимулирующее воздействие аллогенных клеток на заживление ран;
• Эпидермальный фактор роста (EGF)-усиливает пролиферацию и миграцию кератиноцитов;
• Фактор роста кератиноцитов (KGF)-усиливает заживление и эпителизацию ран;
• Трансформирующий фактор роста (a-NGF) активно влияет на ангиогенез.
Кроме того, фибробласты продуцируют компоненты внеклеточного матрикса: нидоген, ламинин, тинасцин, хондроитин-4-сульфат, протеогликан.